细胞注意处理事项

胎牛血清及其它血清中可能存在的沉淀物：①纤维蛋白（常见，1-2mm 肉眼可见，低温收集时纤维蛋白原分装后在瓶中凝结）；②磷酸钙（使血清浑浊，37℃培养时增加，倒置显微镜下呈布朗运动小黑点，常被误认为污染）；③胆固醇、脂肪酸酯及蛋白质。

官网根据实验与使用经验说明，这类沉淀通常不影响细胞培养；大量沉淀物会增加过滤难度——血清出厂已经过 100nm/40nm 过滤与无菌检测，不建议再次过滤；磷酸钙常被误认为微生物污染，建议将血清加到琼脂板上培养观察，或做革兰氏染色油镜确认。

注意正确的解冻步骤，溶解过程每隔一段时间均匀缓慢摇动血清。应避免：①热灭活血清；②37℃ 下培养血清；③反复冻融；④γ 射线照射；⑤长期 2-8℃ 储存；⑥室温放置时间过长。

将血清分装到无菌离心管中，以 400g 离心，上清液直接加入培养基一起过滤。不要以过滤方式去除絮状沉淀，会阻塞滤膜。

不能。血清是重要营养来源，不同物种血清中物质含量不同，用错常导致细胞无法存活。

FBS 与 FCS 同义，均指胎牛血清（FCS 为错误用词）。CS 指小牛血清，HS 指马血清。

不能。每一细胞株均有其适应的培养基，突然更换培养条件可能使细胞无法适应并影响存活。官网说明其细胞株培养液使用 Gibco 干粉配制，建议准备相同条件的培养液。

重要。脱掉氨基后可作为细胞能量来源，参与蛋白质合成与核酸代谢。其在溶液中会逐渐降解产生对细胞有毒性的氨。

取决于培养基 NaHCO₃ 含量：每升 3.7g 时用 10% CO₂，每升 1.5g 时用 5% CO₂。

视细胞生长密度而定，或遵照细胞株基本数据上的更换时间按时更换。

除特殊筛选系统外，正常培养状态下不应添加任何抗生素。

4°C 储存时 CO₂ 逐渐逸出，可能使培养基偏碱，酚红指示剂颜色也会加深。偏碱会影响细胞生长；官网提出可使用无菌过滤的 CO₂ 调节 pH。

不同品牌的表面聚合物处理与制造工艺有所差异，部分细胞的生长可能因此受到明显影响。

用无血清培养基把细胞悬液稀释到 200~2000 个/毫升，0.1ml 细胞悬液 + 0.1ml 0.4% 台盼蓝溶液轻混，数分钟后血球计数板计数。活细胞排斥台盼蓝，染蓝的是死细胞。

一般使用 0.05% trypsin-0.53mM EDTA·4Na。开瓶后立即少量分装于无菌试管 -20°C 保存，避免反复冻融降低活性并减少污染。

向原培养瓶持续加入新鲜培养基稀释细胞浓度即可；分瓶时取部分含细胞培养液至新瓶，加新鲜培养基稀释，重复即可。

一般 300×g（约 1000rpm）离心 5 分钟，过高转速将造成细胞死亡。

依照细胞株基本数据的接种密度或稀释分盘比例接种。细胞数太少或稀释过多都会导致无法生长。

两者均为可用于细胞核染色的蓝色荧光染料。官网介绍 33342 的细胞通透性较强、细胞毒性较小；33258 常用于固定后染色，33342 可用于活细胞染色。

取出后立即放入 37°C 水槽快速解冻，轻摇使其在 1 分钟内全部融化，注意水面不可超过冷冻管盖沿。从液氮桶取出解冻时注意安全，预防冷冻管爆裂。

除少数对 DMSO 敏感细胞外，解冻后直接放入含 10-15ml 新鲜培养基的培养瓶，隔天再置换新鲜培养基去除 DMSO，可避免解冻后细胞无法生长或贴附。

5-10% DMSO + 90-95% 原新鲜培养基均匀混合。DMSO 稀释时放热，不可直接加入细胞液，使用前先行配制。

使用 Tissue culture grade（如 Sigma D2650），本身无菌；开瓶后少量分装 4°C 保存避免反复冻融；若需过滤，须使用耐 DMSO 的 Nylon 材质滤膜。

官网介绍分阶段降温和程序降温两种方式，降温后转入液氮气相长期保存。具体降温程序应按对应细胞说明书执行；官网原文中部分时间格式不清，操作前请联系技术支持确认。

官网给出的一般参考浓度为 1×10⁶ cells/ml/vial，融合瘤细胞为 5×10⁶ cells/ml/vial；实际按细胞资料与实验要求执行。

离心操作造成的物理损伤或细胞流失是官网列出的常见原因。官网建议一般解冻细胞不要立即离心，先培养过夜再换液；特殊细胞以其专用说明为准。

夹取用力不当可能造成损伤，热胀冷缩也可能使瓶盖松动。官网建议小心夹取，并在放入或取出液氮桶时检查瓶盖是否紧固。

先不开盖放培养箱静置数小时后在倒置显微镜下观察并对不同倍数拍照（培养基一张看颜色/漏液、细胞 100×、200× 各一张）；未开封出现污染我们负责免费重发。贴壁细胞未超 80% 汇合度时吸出培养液留 10ml 继续培养；超过则按条件传代。悬浮细胞 1000rpm 离心 2 分钟弃上清，新鲜培养基悬浮移回培养瓶。细胞消化液建议用 PBS 配制，慎用 Hanks 液。

一般外地 2-3 天。寄细胞前请确认当地气温，低于 4℃ 的采用邮寄冻存细胞。

检查培养基与血清的种类和质量、解冻步骤、解冻后洗涤及离心操作、悬浮细胞判断、培养温度，以及是否在 −80°C 放置过久。

污染可能来自无菌操作、操作环境、血清或细胞来源。严格执行无菌操作、保持环境清洁，并使用质量可靠的细胞和培养基。

官网建议将污染细胞灭菌后弃置。

多数情况下不能。支原体污染通常难以仅凭肉眼或细胞外观辨认。

支原体可能影响细胞生长、代谢及研究数据，实验前应确认细胞未受支原体污染。

官网建议灭菌后弃置，避免污染其他细胞。

定期更换无菌蒸馏水或无菌去离子水，官网建议至少每两周一次。